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檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 。往 預先包被植物果糖(GTD)酶聯免疫吸附測定試劑盒 抗體的包被微孔中,依 次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并洗滌。 用底物TMB顯色,TMB在化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的 作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的(GTD)酶聯免疫吸附測定試劑盒 呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度 (OD 值) ,計算樣品活性。
樣品收集、處理及保存方法
1. 樣本不能含疊氮鈉 (NaN3) ,因為疊氮鈉 (NaN3) 是辣根 化物酶 (HRP) 的劑。
2. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行。
3. 植物萃取液或其它相關樣本:請1000 x g離心20分鐘,取上清 即可檢測。
4. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存
于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀 (450nm)
2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在 2-8℃ ,使用前室溫平衡 20 分鐘。從冰箱取出的 濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正常現象,水浴加熱使結晶溶解 后再使用。
2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封 (低溫干燥) 保 存。
3. 濃度為 0 的 S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白;按照說明 書操作時樣本已經稀釋 5 倍,最終結果乘以 5 才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
| 名稱 | 96 孔配置 | 48 孔配置 | 備注 |
| 微孔酶標板 | 12 孔×8 條 | 12 孔×4 條 | 無 |
| 標準品 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 | 無 |
| 樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
| 檢測抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
| 20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
| 底物 A | 6mL | 3mL | 無 |
| 底物 B | 6mL | 3mL | 無 |
| 終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
| 封板膜 | 2 張 | 2 張 | 無 |
| 說明書 | 1 份 | 1 份 | 無 |
| 自封袋 | 1 個 | 1 個 | 無 |
注:標準品 (S0-S5) 濃度依次為:0,20,40,80,160,320 U/mL
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按 1:20 稀釋,即 1 份的20×洗滌 緩沖液加 19 份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置 1min 后甩盡 孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板 5 次。
2. 自動洗板機:每孔注入洗液 350 μL,浸泡 1min,洗板 5 次。
1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自 封袋密封放回4℃。
2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品 50 μ L;
3. 樣本孔先加待測樣本 10 μL,再加 40 μL;空白孔不 加。
4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根化物酶 (HRP) 標記的檢測抗體 100 μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋 或恒溫箱溫育 60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置 1min,甩去 洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板 5 次 (也可用洗板機洗板) 。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50 μL,37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入終止液 50 μL,15min 內,在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。
結果判斷
繪制標準曲線:在 Excel 工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應 OD 值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣 本濃度值。
免責聲明
1. 試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或實驗,否則所 產生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。
2. 嚴格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者 承擔。
試劑盒性能
1. 準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數 R 值,大于等于
0.9900。
2. 靈敏度:檢測濃度小于 0.1 U/mL。
3. 特:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性:板內、板間變異系數均小于 15%。
5. 貯藏:2-8℃ ,避光防潮保存。
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