產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

綠色熒光FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽會(huì)選擇性結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白。鬼筆環(huán)肽衍生物經(jīng)常以納摩爾濃度使用，常在甲醛固定和透化的組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)或無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中用于標(biāo)記、鑒定和定量F-肌動(dòng)蛋白的便捷探針。鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)合比與肌動(dòng)蛋白單體的結(jié)合要緊密得多，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基從絲端解離的速率常數(shù)降低，從而通過(guò)防止絲解聚而基本穩(wěn)定了肌動(dòng)蛋白絲。而且，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動(dòng)蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中不同濃度下的功能不同。當(dāng)以低濃度引入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，鬼筆環(huán)肽將聚合度較低的胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白和纖維蛋白吸收到聚集的肌動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定“島"中，但它不會(huì)干擾應(yīng)力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是研究F-肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中分布的有效工具，方法是用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并將其用于染色肌動(dòng)蛋白絲以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已被證明在定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲以及體外觀察單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率研究肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的重要工具。

產(chǎn)品性質(zhì)

1.分子式（Molecular Formula）：C56H60N10O15S2

2.分子量（Molecular Weight）：1177.3

3.最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)（Ex/Em）:495~496/513~516nm

4.多肽序列（Sequence）:FITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3   to 6)

5.外觀（Appearance）:黃色粉末（凍干粉）

6.溶解性（Solubility）:溶于DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液（20%）

本品以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），總共可做300T。

warbio 生物也提供粉末形式，濃度自行配置使用, 可直接溶于甲醇或DMSO配置成適當(dāng)濃度的儲(chǔ)存液。之后用PBS或PBS+1% BSA稀釋到合適的工作濃度。常用工作濃度范圍80-200nM。

注意事項(xiàng)：    

鬼筆環(huán)肽的分子量小，很容易通過(guò)細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

自備實(shí)驗(yàn)材料

1.1 FITC Phalloidin（貨號(hào)LX4520）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號(hào) SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號(hào) 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號(hào) J8660）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

操作步驟

1. 工作液準(zhǔn)備

1）對(duì)于FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（貨號(hào)：LX4520）

本品以溶于甲醇的20µM儲(chǔ)存液形式提供，總量為300µl。按照100 nM的工作液濃度來(lái)?yè)Q算，可制備總量為60 ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）對(duì)于FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（貨號(hào)：LX2226）

Warbio生物凍干粉形式提供，分子量為1177.3，總量為1mg。可先用甲醇或者DMSO充分溶解配制成20~100µM的儲(chǔ)存液。如，加入8.494ml甲醇到1mg鬼筆環(huán)肽即得到100µM等量的儲(chǔ)存液，根據(jù)單次使用量，進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 染色步驟

1）細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h，使其密度達(dá)到50%匯合度。

2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3）使用溶于PBS的4%溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^(guò)程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

4）室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6）室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

7）取200µl配制好的 FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過(guò)程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

8）用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

9）使用200µl DAPI溶液（濃度：100 nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30s。

10）用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（合并步驟9）10），簡(jiǎn)化步驟。

11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=496/516nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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