染料法熒光PCR的數據與探針法的相比，除了擴增曲線之外，還增加了熔解曲線分析。如何確定數據是好是壞？好的話，數據可以使用；壞的話，需要查明原因，擬定下一步的體系優化方案。這里探討如何確定數據是好是壞，如果不好，查明原因，如何擬定下一步的優化方案。

熔解曲線分析

熔解曲線分析是在定量PCR中常用的一種定量測定方法。

原理：由于在PCR定量分析中利用的是在低溫復性後，擴增產物會按堿基互補配對原則結合成DNA雙鏈，而有的熒光素在與雙鏈DNA結合產生活化，能產生熒 光效應。但由于反應中存在少量的非特異聚合體（如引物二聚體等），能引起干擾，但非特異聚合體的熔解溫度較特異性結合低，當擴增結束後，再緩慢加溫，當 DNA變性後，染料被釋放，熒光減少，而非特異性結合先于特異性結合減少，對熔解過程進行連續動態監測可得熔解曲線，通過曲線將非特異性訊號和特異性訊號 區分出來，同時對特異性訊號區，熒光減少的快慢與濃度的對數成正比。

目的：減小非特異性結合和引物二聚體的影響。用導數來提高分析率。

用途：除正常測定外，可用來進行突變分析。

方法：1.在擴增完後，緩慢升高溫度，同時對熒光進行連續監測，可以得到如下曲線：t1是擴增終點，t2是非特異性結合分離點，t3是DNA開始變性點。

 

2.分析上圖可知，t3以後是特異結合分離區，其熒光下降速度與終點擴增的基因成正比，但因為擴增是按等比數列增長，因此實際上是特異結合分離區熒光下降速度與樣本含量的對數成正比。由公式可得出標本濃度。

優點：熔解曲線法定量PCR，排除非特異性結合的干擾，提高了測定的準確性和靈敏度，同時還能用于基因突變的分析。（原理：含突變位點的基因結合較正常基因不穩定）

以下面的數據為例，通過熔解曲線和擴增曲線相結合，來介紹染料法熒光PCR數據分析的簡單流程。

舉例一、選取同一個基因，先看擴增曲線（RN VS CYCLER）：

 

擴增曲線成s 型，形態可以；再看擴增曲線（Delta RN VS CYCLER）：

 

Delta RN VS CYCLER 的擴增曲線形態也是比較標準的；二者都很正常時，再轉向熔解曲線， 這時，我們發現熔解曲線不太正常。

 

熔解曲線比較雜亂，有的溶解曲線是雙峰，有的熔解曲線是單峰，report 表示，有的tm在85度，有的是在89度。峰的位置也不相同。需要仔細分析，通過復孔，陰性對照等來分析數據。疑問是：產物是否相同？不同Tm的報告是真實的還是儀器的一種誤差？

值得提醒的是，不同儀器的report 結果不同，如ABI 的7000系列，只report 主要的tm；；而rotorgene 系列，則會報告每一個小峰的tm。

仔細看每個孔，選取其中正確的熔解曲線：

 

正確的熔解曲線：在某一特定溫度處有尖銳的單峰，該峰所在的溫度Tm，一般與引物設計及合成時的預測值比較接近。從樣本的角度，即采用了什么樣得樣本，孔 位置的角度（這幾個結果好的樣本孔是否相連，是否位于擴增儀的同排或者同列的位置），復孔的情況是否相似；操作的角度來進行分析和判斷；

正確的熔解曲線的數據，它的CT值是可以用的，可以進行成對的數據分析，如進行Δct分析。

不正確的熔解曲線的數據，要分析形成的原因。

選擇熔解曲線結果不好的孔，來分析：

 

這幾個孔的熔解曲線出現了雙峰，甚至三峰；峰的位置是否相同；結果是否可以認為是類似的原因造成的？ *峰的位置和第二峰的位置是否可以認為是一樣的；通過調整程序是否能降低非特異反應？

復孔的情況怎么樣：

 

分析所有復孔情況，看結果是否吻合。上圖的這個熔解曲線是復孔的熔解曲線，這樣可以說明，在一定程度存在非特異擴增的時候，第二峰的tm可能有一定差異；而這是兩個相同樣本的結果。而熔解曲線結果比較好的時候，復孔的結果也是不錯的。

好的熔解曲線和差的熔解曲線放在一起分析：

 

上圖中有一對復孔熔解曲線比較好，基本可以認為是單峰；一對復孔熔解曲線出現了雙峰；其實仔細看，好的熔解曲線前面也有一個很小很小的峰，位置和不好的雙峰是相同的。那么可以認為，差的熔解曲線也出現了特異性產物，雖然前面有一個非特異的峰。

好的熔解曲線和差的熔解曲線放在一起分析，轉過來看擴增曲線：

 

經常要對應二者來看的。

再看陰性對照的熔解曲線是正常的，未被污染。再來看熔解曲線：

 

基本上分成兩種；好的和不好的；而不好的與好的，在熔解曲線的峰上就分析而言，是吻合的；需要調整程序，降低非特異性擴增；具體表現在程序上，就是提高退火溫度，縮短延伸時間。

結論：基本得到目的產物，下一步工作是優化反應程序，提示：提高退火溫度，縮短延伸時間；

如果采用統一退火反應條件，對于不好的引物，建議直接重新設計引物，合成，以便得到好的實驗結果。

原文地址:/biotech/exp/PCR/2011/h821102252.html