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免疫組化非特異性背景染色及其控制方法

2011年05月25日 11:44:14人氣:1323來源:上海莼試生物技術有限公司

一、 非特異性染色的識別常出現在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處,壞死組織及固定不良的組織中心處。表現為彌漫性,均勻性的背景染色。也可以是隨機分布的陽性反應產物點、團或塊狀。
二、非特異性染色的原因1. Ig與Fc受體結合
多見于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,淋巴細胞,單核細胞,組織細胞表面多),主要是和二抗反應,因為一抗一般稀釋度均較大,因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,所以石蠟切片不多見。
避免方法:
① 用以二抗相同種族的正常血清封閉切片;
② 用不含Fc段的抗體,但價格貴
(V區,C1區不含Fc段,用Pepsin消化)
2.靜電吸附
抗體是一種帶負電荷的球蛋白,容易和帶正電荷的組織相結合,如膠原纖維。
避免方法:
① 盡量稀釋一抗
② 降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
③ 用去垢劑 如triton-100處理切片。 Tween-20等;
3.二抗與組織中的Ig結合
如羊抗兔的二抗,二抗可以標本中(人)Ig發生交叉反應,科學上越接近的動物,交叉反應越
明顯,如人與猴,兔與豚鼠。
避免方法:用與待測組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。
4.組織中殘存醛基與Ig的結合
如醛類固定后未能*的沖洗,殘流醛基可以和Ig結合。
避免方法:
①*沖洗;
② 0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗;
5.內源性過氧化物酶
紅細胞,粒細胞的含量尤其高,鏡下可以識別,不要將其當成陽性結果。
避免方法:
① 石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片;
② 冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘(99:1)因為未經固定包埋,大部分酶未被破壞;
③ 對于骨髓涂片用非過氧化物酶標記的抗體
如堿性磷酸酶(AP)

磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料

快蘭(fast blue)或快紅(fast red)
↓ ↓
蘭色 紅色
用明膠甘油封片,不能用含二甲苯的封片劑,溶于二甲苯。
6. 內源性*
以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘;
7. 交叉反應
PcAb敏感性高,但特異性稍低,容易出現非特異性染色。
避免方法:
①盡可能稀釋抗體;
②盡可能用McAb;
三、 抗體zui大稀釋度的求法
zui大稀釋度的目的:
1.節約、
2.特異性染色↑、非特異性染色↓(決定其zui大稀釋度)
棋盤法
如 稀釋度
1:50 1;100 1:150 1;200
特異性染色 +++ ++ ++ +
非特異性染色 ++ + - -
免疫組化操作規程
(一)、儀器設備1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐; 2)水浴鍋
(二)、試劑
1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。
3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O,用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
5)酶消化液: a、0.1%*液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%*液:用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7)封裱劑:
a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;
b、油和TBS(或PBS)配制。
8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標本;pH7.0~7.4適合于光學顯微鏡標本。
(三)、操作流程
1、脫蠟和水化
脫蠟前,應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后再浸泡10分鐘;
2)無水乙醇中浸泡5分鐘;
3)95%乙醇中浸泡5分鐘;
4)70%乙醇中浸泡5分鐘;
2、抗原修復
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
1)抗原熱修復
(1)高壓熱修復 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M*緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子,但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后,去除熱源,置入涼水中,當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。
(2)煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M*緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10~15分鐘。
(3)微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M*緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5~10分鐘,反復1-2次。適用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法 常用0.1%*和0.4%*液。*使用前預熱至37℃,切片也預熱至37℃,消化時間約為5~30分鐘;*消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。
3、免疫組織化學染色
SP法
1)脫蠟、水化;
2)PBS洗2~3次各5分鐘;
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘;
4)PBS洗2~3次各5分鐘;
5)抗原修復;
6)PBS洗2~3次各5分鐘;
7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8)滴加Ⅰ抗50μl,室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9)4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。
10)PBS洗3次各5分鐘;
11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置,或37℃1小時;
12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
13)PBS洗3次各5分鐘;
14)DAB顯色5~10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度;
15)PBS或自來水沖洗10分鐘;
16)蘇木精復染2分鐘,鹽酸酒精分化;
17)自來水沖洗10~15分鐘;
18)脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1)脫蠟、水化。
2)PBS洗兩次各5分鐘。
3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。
4)抗原修復。
5)PBS洗5分鐘。
6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時(4℃過夜后在37℃復溫45分鐘)。
8)PBS洗三次每次2分鐘。
9)滴加*化二抗,20℃~37℃20分鐘。
10)PBC洗3次每次2分鐘。
11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。
12)PBS洗4次每次5分鐘。
13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15)脫水、透明、封片、鏡檢。

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