1　主題內容與適用范圍
　　本標準規定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗方法。
　　本標準適用于出口食品的檢驗。

2　設備和材料
2.1　吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。
2.2　水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3　培養箱：36±1℃,44.5±0.5℃。
2.4　冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。
2.5　均質器。
2.6　乳缽和研棒。
2.7　平皿：直徑90mm。
2.8　天平：感量0.1g。
2.9　顯微鏡。
2.10 稀釋瓶：100mL、200mL和500mL三角燒瓶及廣口瓶。
2.11 玻璃珠：直徑約5mm。
2.12 菌落計數器。

3　培養基及試劑
3.1　月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示）（LST）肉湯。
3.2　煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯。
3.3  EC 肉湯。
3.4　伊紅美藍瓊脂（EMB）。
3.5　營養瓊脂斜面。
3.6　*肉湯。
3.7  MR-VP培養基。
3.8  Korser氏枸椽酸鹽肉湯。
3.9　結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）。
3.10　Butterfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液。
3.11 生理鹽水。
3.12 革蘭氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基質試劑。
3.14 甲基紅指示劑。
3.15 Voges-pros kauer（V-P）試劑。

4　樣品制備
4.1　以無菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用75％乙醇在開口處擦拭后取樣。若不能及時檢驗,應將冷凍樣品置于-15℃保存；非冷凍而易腐的食品,應置于4℃冰箱保存。檢驗前冷凍樣品可于2～5℃ 18h內解凍,或在45℃以下15min內解凍。
4.2　不同食品樣品勻液的制備
4.2.1　液體食品
以滅菌吸管取樣25mL放入裝有225mL稀釋劑的滅菌玻璃瓶（瓶內預置適當數量的玻璃珠）,以30cm幅度、于7s內振搖25次（或以機械振蕩器振搖）,制成1:10的樣品勻液。
4.2.2　固體和半固體食品
　　以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質杯內,于8000 r/min均質1～2min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代替）。
4.3　稀釋樣品勻液根據對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。

5　大腸菌群的測定
5.1　大腸菌群MPN值的測定
5.1.1　對每個樣品,選擇適宜的三個連續稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示）（LST）肉湯,每管接種1mL。
5.1.2　將接種管置于36±1℃培養48±2h。
5.1.3　觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生,記錄在24h和48h內產氣的LST肉湯管數。如所有LST肉湯管均未產氣,則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者,則進一步作證實試驗。

5.2　大腸菌群的證實試驗
5.2.1　將所有產氣管用直徑為3mm的接種環移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。
5.2.2　置BGLB肉湯管于36±1℃培養48±2h。
5.2.3　記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。
5.2.4　結果報告：按BGLB肉湯產氣管數,查MPN表[見附錄B （補充件）]報告每克（毫升）樣
品中大腸菌群的MPN值。

6　糞大腸菌群測定
6.1　用直徑為3mm的接種環將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養物移種于EC肉湯管中。
6.2　將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養24±2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養基液面。應以已知為44.5℃產氣陽性的大腸桿菌和44.5℃不產氣的產氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。
6.3　記錄EC肉湯管的產氣情況。產氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產氣管為糞大腸菌群試驗陰性。
6.4　結果報告：按產氣管數,查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。

7　大腸桿菌測定
7.1　將6.3條中的EC肉湯管繼續培養24h,取其產氣管的培養物劃線接種于伊紅美藍（EMB）平板,36±1℃培養24±2h。
7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
7.3　如有典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養瓊脂斜面上,36±1℃培養18～24h。
7.4　將斜面培養物移種到下列培養基中進行生化試驗。
7.4.1　*肉湯：在36±1℃培養24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現紅色為靛基質陽性反應。
7.4.2 MR-VP培養基：在36±1℃培養48±2h。以無菌操作移取培養物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現伊紅色,為VP試驗陽性。
　　將MR-VP培養物的剩余部分再培養48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。
7.4.3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養96h記錄有無生長。
7.4.4 LST肉湯：于36±1℃培養48±2h,觀察試管中是否產氣。
7.4.5　革蘭氏染色：取18h營養瓊脂斜面培養物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。
7.4.6　大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：

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　　靛 基 質┃　　 MR　　 ┃ 　　VP　　 ┃　 枸椽酸鹽 ┃ 鑒定（型別）
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　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃典型大腸桿菌
　　　　－　┃ 　　＋　 　┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃非典型大腸桿菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃　　 －　　 ┃ 　＋ 　　　┃典型中間型
　　　　－　┃　　 ＋ 　　┃ 　　－ 　　┃ 　＋　　　 ┃非典型中間型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　－　┃　　 － 　　┃　　 ＋　　 ┃　 ＋　　　 ┃典型產氣腸桿菌
　　　　＋　┃　　 － 　　┃ 　　＋ 　　┃ 　＋ 　　　┃非典型產氣腸桿菌
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　　如出現上表以外的生化反應類型,表明培養物可能不純,應重新劃線分離,必要時做重復試驗。
7.5　結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發酵乳糖產酸產氣,IMViC試驗為＋＋--或－＋--,再根據LST肉湯陽性管數查MPN表,報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。

8　大腸菌群固體培養基測定法
8.1　樣品制備同第4章。
8.2　計數
8.2.1　選取適宜的三個連續稀釋度的樣品液,每個稀釋度接種兩個滅菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀釋劑加入一個滅菌平皿中,作空白對照。
8.2.2　將冷至45±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）10～15mL傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養基與樣液充分混勻。
8.2.3　待瓊脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆蓋平板表層。
8.2.4　翻轉平板,置于36±1℃培養18～24h。
8.2.5　選用有30～150個菌落的平板,計數平板上出現的典型大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環。菌落直徑為0.5mm或更大。
8.2.6　證實
8.2.6.1　從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,移種于BGLB肉湯管內, 36±1℃培養24h和48h,觀察產氣情況。
8.2.6.2　將出現產氣的肉湯管判為大腸菌群陽性。對形成菌膜的陽性管,應進行革蘭氏染色,以便排除革蘭氏陽性桿菌。
8.2.7　結果報告
　　經zui后證實為陽性（產氣,革蘭氏陰性桿菌） 的試管百分比乘以于8.2.5條中計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每克（毫升）樣品中大腸菌群數。
　　例：10**-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接
種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為：
　　100×6/10×10**4/g（mL）＝6.0×10**5/g（mL）
附　錄 A　
　　　　　　　　　　　　　　培養基和試劑
　　　　　　　　　　　　　　　（補充件）
A1　月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示）（LST）肉湯
　　胰蛋白（月示）或胰酪胨（Trypticase） 20g
    氯化鈉　　　　　　　　　　　　　5.0g
　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　5.0g
　　*（K2HPO4）             2.75g
　　磷酸二氫鉀（KH2PO4）             2.75g
　　月桂基硫酸鈉                    0.1g
　　蒸餾水                      1000.0mL
　　將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發酵管的20mm×150mm試管中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。zui終pH6.8±0.2。

A2　煌綠乳糖膽鹽（BGAB）肉湯
　　蛋白胨                        10.0g
　　乳糖　                        10.0g
　　牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200.0mL
　　0.1％煌綠水溶液              13.3mL
　　蒸餾水                     1000.0mL
　　將蛋白胨乳糖溶于約500mL蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中,pH7.0～7.5）,用蒸餾水稀釋到975mL,調pH7.4。再加入0.1％煌綠水溶液13.3mL,用蒸餾水補足到1000mL,用棉花過濾后,分裝到20mm×150mm試管（管內有倒立的小發酵管）中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。zui終pH7.2±0.1。

A3 EC肉湯
　　胰蛋白（月示）或胰酪（月示）     20.0g
　　3號膽鹽或混合膽鹽　　　      1.5g
　　乳糖　　　　　　　　　　      5.0g
　　*（K2HPO4）            4.0g
　　磷酸二氫鉀（KH2PO4）            1.5g
　　氯化鈉　　　                  5.0g
　　蒸餾水                    1000.0mL
　　將以上成分溶解于蒸餾水中,分裝16mm×150mm試管（管內有倒立的小發酵管）,每管8mL。121℃高壓滅菌15min,zui終pH6.9±0.1。

A4　伊紅美藍瓊脂（EMB）
　　蛋白胨                      10.0g
　　乳糖                        10.0g
　　*（K2HPO4）           2.0g
    瓊脂                        15.0g
　　伊紅γ（水溶性）　　 0.4g或2％水溶液20mL
　　美藍　　　　　　　0.065g或0.5％水溶液13mL
　　蒸餾水　　　　　　       1000.0mL
　　在1000mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂,加水補足至原量。分裝于三角燒瓶中。每瓶100mL或200mL,高壓滅菌15min。zui終pH7.1±0.2。使用前將瓊脂融化,于每100mL瓊脂中加5mL滅菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊紅γ水溶液和1.3mL0.5％的美藍水溶液,搖勻,冷至45～50℃傾注平皿。

A5　營養瓊脂斜面
　　牛肉膏　　　　　　　　　　  3.0g
　　蛋白胨 　　　　　　　　　　 5.0g
　　瓊脂                       15.0g
　　蒸餾水                  1000.0mL
　　將各成分加于蒸餾水中,煮沸溶解。分裝合適的試管。121℃高壓滅菌15min。zui終pH7.3±0.1。滅菌后擺成斜面備用。

A６　*肉湯
　　胰胨或胰酪胨               10.0g
　　蒸餾水                  1000.0mL
　　加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管,每管5mL。121℃高壓滅菌15min。zui終pH6.9±0.2。

A7 MR-VP培養基
　　（月示）胨　　　　　　　　　　7.0g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　　5.0g
　　*（K2HPO4）          5.0g
　　蒸餾水                    1000.0mL
　　將各成分溶于蒸餾水中,分裝試管,121℃高壓滅菌15min,zui終pH6.9±0.2。

A8 Koser氏枸椽酸鹽肉湯
　　磷酸氫銨鈉（NaNH4HPO4·4H2O）　1.5g
　　*（K2HPO4）           1.0g
　　*（MgSO4·7H2O） 　　　　 0.2g
　　枸椽酸鈉（含2H2O）　　　　　　 3.0g
　　蒸餾水                   1000.0mL
　　將各成分溶解于蒸餾水中,分裝試管,每管10 mL,121℃高壓滅菌15min。zui終pH6.7±0.2。

A9　結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
　　蛋白胨　　　　 　　　       7.0g
　　酵母膏　　　　 　　　　     3.0g
　　乳糖　　　　　　　　　     10.0g
　　氯化鈉　　　　　　　        5.0g
    膽鹽或3號膽鹽　　　        1.5g
　　中性紅　　　　　　　　     0.03g
　　結晶紫　　　　　　　　    0.002g
　　瓊脂                     15～18g
　　蒸餾水　　　　　　　　  1000.0mL
　　將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分攪拌,調至pH7.4±0.1。煮沸2min,將培養基冷至45～50℃傾注平板。臨用時制備,不得超過3h。

A10 Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液 
　　貯存液
　　磷酸二氫鉀（KH2PO4）        34.0g
　　蒸餾水                    500mL
　　將磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中,用1 mol/L氫氧化鈉約175 mL調至pH7.2。用蒸餾水加至1000mL貯存于冰箱。
　　稀釋液
　　取貯存液1.25mL, 用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于合適容器后,121℃高壓滅菌15min。

A11 生理鹽水
　　氯化鈉　　　　　　　　　  8.5g
　　蒸餾水                1000.0mL 
　　將氯化鈉溶于蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min。

A12 革蘭氏染色液
　　結晶紫染色液：
　　結晶紫　　　　　　　　   1.0g
　　95％乙醇               20.0mL
　　1％草酸銨水溶液        80.0mL
　　將結晶紫*溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
　　革蘭氏碘液：
　　碘　　　　　　　　　　 1.0g
　　*　　　　　　　　 2.0g
　　蒸餾水              300.0mL
　　將碘與*先行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待*溶解后,再加蒸餾水至300mL。
　　沙黃復染液：
　　沙黃　　　　　　　　 0.25g
　　95％乙醇            10.0mL
　　蒸餾水              90.0mL
　　將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
　　染色法
　　a. 將涂片在火焰上固定,滴加結晶紫染液,染1min,水洗。
　　b.　滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗。 
　　c. 滴加95％乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
　　d.　滴加復染液,復染1min,水洗、待干、鏡檢。
    結果：革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。

A13 Kovacs氏靛基質試劑
　　對二甲氨基苯甲醛　　　　 5.0g
　　戊醇                   75.0mL
　　鹽酸（濃）               25.0mL
　　將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入濃鹽酸即可。

A14 甲基紅指示劑
　　甲基紅                  0.1g
　　95％乙醇               300mL
　　將甲基紅溶解于300mL乙醇中,加水稀釋至500mL。

A15 Voges-Pros kauer（V-P）試劑
　　甲液　
　　α-萘酚　　　　　　　　 　5.0g
　　無水乙醇              100.0mL
　　乙液
　　氫氧化鉀                40.0g
　　用蒸餾水加至          100.0mL

附　錄 B
　　　 　　　　　　　　　 1g檢樣中zui近似值（MPN）表
　　　　　　　　　　　　　　　　 （補充件）
使用三管法,接種量分別為0.1,0.01和0.001g。

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陽 性 管 數　　　 ┃　　　　┃　　　陽 性 管 數　 ┃
━━━━━━━━━┫　MPN 　┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001　 ┃　　　　｜ 0.1 0.01 0.001　　┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
　0　 0　 0　　　 ┃ ＜3 　┃　 2　 0　 0　　　　┃ 9.1
　0　 0　 1　　　 ┃　 3　 ┃　 2　 0　 1　　　　┃ 14
　0 　0　 2　　　 ┃ 　6　 ┃　 2　 0　 2　　　　┃ 20 
　0 　0　 3　　　 ┃　 9　 ┃　 2　 0　 3　　　　┃ 26 
　0　 1　 0　　　 ┃　 3　 ┃ 　2　 1　 0　　　　┃ 15 
　0　 1　 1　　　 ┃ 　6.1 ┃　 2　 1　 1　　　　┃ 20 
　0 　1　 2　　　 ┃　 9.2 ┃ 　2　 1　 2　　　　┃ 27 
　0　 1　 3　　　 ┃　　12 ┃　 2　 1　 3　　　　┃ 34 
　0　 2　 0　　　 ┃　 6.2 ┃ 　2　 2　 0　　　　┃ 21 
　0　 2　 1 　　　┃ 　9.3 ┃　 2　 2　 1　　　　┃ 28 
　0　 2　 2　　　 ┃　 12　┃　 2　 2　 2　　　　┃ 35 
　0　 2　 3　　　 ┃ 　16　┃ 　2　 2　 3　　　　┃ 42 
　0　 3　 0　　　 ┃　 9.4 ┃　 2　 3　 0　　　　┃ 29
　0　 3　 1　　　 ┃　 13　┃　 2　 3　 1　　　　┃ 36 
　0　 3　 2　　　 ┃　 16　┃ 　2　 3　 2　　　　┃ 44 
　0　 3　 3　　　 ┃　 19　┃　 2　 3　 3　　　　┃ 53 
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
　1　 0　 0　　　 ┃　 3.6 ┃ 　3　 0　 0 　　 　┃ 23
　1　 0　 1　　　 ┃ 　7.2 ┃　 3　 0　 1　　　　┃ 39
　1　 0　 2　　　 ┃ 　11　┃　 3　 0　 2　　　　┃ 64
　1　 0　 3　　　 ┃　 15　┃　 3　 0　 3　　　　┃ 95
　1　 1　 0　　　 ┃ 　7.3 ┃ 　3　 1　 0　　　　┃ 43
　1　 1　 1　　　 ┃　 11　┃ 　3　 1　 1　　　　┃ 75
　1　 1　 2　　　 ┃ 　15　┃ 　3　 1　 2　　　　┃ 120
　1　 1　 3　　　 ┃　 19　┃ 　3　 1　 3　　　　┃ 160
　1　 2　 0　　　 ┃　 11　┃ 　3　 2　 0　　　　┃ 93
　1　 2　 1　　　 ┃　 15　┃　 3　 2　 1　　　　┃ 150
　1　 2　 2　　　 ┃ 　20　┃ 　3　 2　 2　　　　┃ 210
　1　 2　 3　　　 ┃　 24　┃ 　3 　2　 3　　　　┃ 290
　1　 3　 0　　　 ┃　 16　┃ 　3　 3　 0　　　　┃ 240
　1　 3　 1 　　　┃ 　20　┃ 　3　 3　 1　　　　┃ 460
　1　 3　 2　　　 ┃ 　24　┃　 3　 3　 2　　　　┃ 1100
　1　 3　 3　　　 ┃ 　29　┃ 　3　 3　 3　　　　┃＞1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
注: ①本表采用3個稀釋度 [0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）],每個稀釋度接種3管。
　 ②表內所列檢樣量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）時,表內數字應相應降低10倍；如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）和0.0001g（mL）時,則表內數字應相應增加10倍,其余類推。