酶聯免疫（ELISA）使用試劑盒檢測過程中值得關注的問題  

1、儀器質控
 為使儀器保持*工作狀態，應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機和酶標儀。
◎移液器： ELISA加樣量小（20-200μl），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±5%以內；
◎恒溫箱： 經常檢查恒溫箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機： 每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規定，一般不超過2μl；人工扣板時，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；
◎酶標儀：經常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。

2、試劑盒選擇
◎應盡量選擇正規廠家，產品經相應政府部門審核認可，試劑應從靈敏度、特異性、精密度、穩定性、簡便性、安全性及經濟性全面評價。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質的zui低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。
◎特異性：常用交叉反應率表示。含有與待測物相近結構部份的物質可能存在交叉反應，使測定結果升高，可能導致假陽性，所以交叉反應是評價其質量的關鍵指標。
◎精密度：ELISA試劑一般指其批內CV%，其值應小于15%；定量試劑應同時考察線性范圍。
◎準確度：通過添加回收實驗進行評價。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性實驗中結果判斷簡單明了，定量試驗結果計算也應簡單。
◎安全性：指試劑對操作者和環境安全無害無傳染性。
◎經濟性：試劑在同等質量條件下通過大規模生產或技術進步降低成本，而市場價格比較合理。
◎試劑評價：需要有的確證方法和確證的樣品進行檢測。

3、樣本前處理注意事項
3.1 均質
組織樣本:肉、肝食品類切細，用絞肉機反復絞碎，混合均勻。
水產樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細，用均質器均漿；原料表面較臟時,需適當用蒸餾水清洗。
蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。
水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振蕩提取
 將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內的樣品充分接觸以深入到樣本組織內部，提取待測組分。
3.2.1振蕩方式：振蕩器上進行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。
3.2.2 在組織樣本中加入有機溶劑之間提取時，應邊加邊振蕩，防止組織凝結成團，不利于提取。
3.3. 在用有機溶劑提取過程中，如果出現乳化現象，解決的方法有：①用細頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復離心。②再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數不變。
3.4 濃縮
 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮氣下吹干，再用復溶液溶解干燥殘留物。
濃縮方式：
 氮氣吹干除雜、壓縮空氣吹干除雜。
注意：
3.4.1在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質干擾。
3.4.2在吹樣本時，針頭應在液面上空，避免與樣本接觸，防止產生交叉污染。
3.4.3樣本吹干后應立即取下，避免吹的時間過長，影響zui終檢測結果。
3.4.4不同的藥物，吹干后樣本的保質期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復溶。
3.5 凈化
 經過提取的待測組分中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應的雜質或者是含有與待測物結構相似的雜質。將待測組分與雜質分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現有的試劑盒前處理方法中涉及到的zui常見的凈化是：液液分配法。
 比如：用復溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復溶液渦動后如果出現乳化現象，可以60℃水浴加熱，至乳化現象消失或減弱后，加大離心轉速進行離心。
 實例：
 A、*類藥物試劑盒現有的水產樣本前處理方法中，用二氯甲烷作為提取劑。
注意：
 （a）二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要求取適量的下層吹干。
 （b）在用加樣器吸取下層的有機相時，正常操作往往取量不準確，此時用帶有刻度，且刻度較準確的玻璃管來定量。
 （c）上訴情況對有經驗的試驗員還可以通過靈活控制加樣器來控制取樣的準確性。
 （d）在振蕩過程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過程中，如果離心管密封性不是很好，往往容易爆開；在進行振蕩時，不要讓離心管口對準自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。
 （e）試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項目曲線受影響較明顯。
    B、硝基呋喃代謝物檢測過程中常見問題
    硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）和1-氨基-2-內酰脲（AHD）在檢測過程中也需要同其它項目一樣進行添加回收測評，其中需要注意以下幾個問題。
    代謝物在組織中是與蛋白呈結合狀態，采用普通的有機溶劑或緩沖液，是無法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類代謝物游離，所以在加入去離子水、鹽酸和2-硝基苯甲醛（2-NBA）混合均勻后，其pH應在1-3之間，否則不利用水解代謝物。
在衍生化過程中，溫度和時間決定其衍生化產率，衍生化后在加入氫氧化鈉和*時，其pH應在中性左右。由于部分樣本的緩沖能力不同，所以需對其pH進行測定，因為在酸性或堿性環境中，不利于呋喃類代謝物的提取回收，同時也容易出現假陽性。
    添加回收的幾種誤區：
    呋喃類代謝物提取過程通常分三個關鍵步驟：
 水解-----衍生化-----提取
 （1）采用標準曲線的zui大標準濃度進行添加回收。如德國拜發和我公司AOZ試劑盒中的第6個標準點4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個標準點8.1ppb。因為這些標準品是已經過衍生化后的標準品，不能代表樣本前處理實驗中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個步驟，所以就算回收率很高，但失去了實際參考價值。
 （2）*依賴未衍生的代謝物標準品進行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標準品后有一定的有效期，會存在潛在的不穩定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個關鍵點，不能驗證從組織蛋白中水解呋喃類代謝物的過程，因此也有一定的局限性。
 的評價方案：采用經LC-MS-MS確證的陰陽性樣品，留作質控樣品，對檢測的樣本和試劑盒進行質量評價。這也是實驗室所出數據可信度說服力的關鍵點。

4、 酶標分析過程中的注意事項
     樣本的檢測是基于抗原抗體的反應，根據標準曲線，判定樣本zui終的藥物含量。它要求加樣的準確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實驗室溫度的恒定，保證反應在試劑盒所示的溫度下進行。
4.1常見加樣方式
A、吸一打二
B、吸二打一
 在實際操作過程中，提倡用“吸二打一”用這種方式，有如下幾個好處：
 a、加樣過程中在板孔內不出現或者很少出現氣泡
 b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應的時間差。
在加樣的過程中還應細心注意避免出現下列現象：
A、加樣的過程中漏加或者重加；
B、加樣的過程中忘記更換吸頭；
C、樣本的重加或者漏加；
D、忘記記錄樣本的加樣順序。
4.2常見的洗板方式
A、洗板機洗板；
B、多道孔加樣器洗板；
C、多孔吸頭洗板；
   在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過少，則達不到洗滌的效果，容易出現曲線不成線性，花板等情況。
4.3 甩板
 快速甩盡板孔內的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產生交叉污染。
4.4拍板
 輕輕的在吸水紙上扣干板孔內的液體，而且吸水紙只能使用一次。
4.5 顯色
 值得注意的是，并非試劑盒中所規定的顯色時間是的，因為試劑盒的吸光度值會受環境中的溫度、濕度、酶標板反應時所接觸到的物品的導熱度等有關，實驗操作人員在加完顯色液后，可根據顏色的深淺適當的延長或者縮短顯色時間。防止出現吸光值接近或高于酶標儀的zui高檢測靈敏度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會間接影響到檢測結果，如出現曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數值等現象，也就造成了一些假陽性或部分檢測結果偏低的現象。
上海信裕生物科技有限公司誠心祝愿各位實驗師實驗成功，希望這些資料對大家有所幫助

→ELISA試劑盒技術匯總-ELISA的影響因素
→ELISA技術匯總-ELISA測定錯誤結果的原因分析
→ELISA技術匯總-ELISA具體操作法