豬圓環(huán)病毒Ⅱ型PCR檢測試劑盒
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 包裝規(guī)格 |
豬圓環(huán)病毒Ⅱ型PCR檢測試劑盒 | BJ-P7935 | 50T |
運輸：低溫
保存：-20℃避光
有效期：一年
貨期：2-3周
產(chǎn)品用途：公司產(chǎn)品僅供科研研究實驗
試劑組成:
特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品。
2. 根據(jù)保守序列設(shè)計的專一性引物。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
操作流程：
RNA 提取 → 反轉(zhuǎn)錄 → 設(shè)計引物 → Q-PCR
一、 總RNA提取
A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。
B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。
C細(xì)胞樣品：懸浮液中生長的細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞后，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細(xì)胞，有兩種處理方法。一種是移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞?；蚴窍扔脤①N壁細(xì)胞消化下來并收集后，再加入1mL Trizol進行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基。）
二、直接法
1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。
2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中。
3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。
4）4℃，12000rpm離心15min?；旌弦悍秩龑樱ㄗ钕旅娴穆确掠袡C相，中間相和上層水相。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。∟ote：質(zhì)量比數(shù)量更重要！）
5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。
6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。
7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干，過度干燥會導(dǎo)致RNA難溶解?。?。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。
8）立即進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長期保存。
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注意事項:
1、所有步驟均應(yīng)在超凈工作臺上進行，超凈臺紫外照射至少15min。
2、所有試劑應(yīng)為此實驗專用。
3、使用75％乙醇或其他去污劑擦拭工作臺，避免表面污染。
4、進入熒光定量PCR 操作實驗室后需要佩戴一次性無菌口罩、無菌乳膠手套、實驗中盡量避免與同事交談，防止PCR 模板污染。
5、實驗中使用各種規(guī)格的離心管，槍頭及配制試劑和溶解沉淀用的水，均應(yīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。
6、使用Trizol試劑時，避免接觸皮膚或衣服。避免吸入蒸氣。
7、qPCR反應(yīng)需要qPCR級水，試劑和試管。請務(wù)必使用正確類型的qPCR光學(xué)PCR管和蓋子。不可用普通的PCR管。
8、加樣前，先布局，規(guī)劃加樣順序以避免交叉污染。
9、所有實驗應(yīng)均應(yīng)設(shè)置無模板對照，其中包含除DNA或cDNA樣品以外的所有反應(yīng)組分。
10、先配制qPCR反應(yīng)混合液，減少誤差。
11、加樣后上機前，務(wù)必通過瞬離將反應(yīng)液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因為氣泡會干擾熒光檢測且降低酶活性，從而降低擴增效率。
