ImageStream 技術建立在傳統的流式細胞術基礎之上,結合了熒光顯微成像技術,它具有多個檢測通道,可以對通過流動室中的每個細胞進行成像,實現了對細胞圖像進行多參數量化分析,獲得全新的細胞形態統計學數據。
ImageStream 技術與傳統流式細胞儀很類似,其系統平臺也是由液流系統,光學系統和檢測系統三大部分組成。液流系統通過注射泵將樣本細胞懸液和鞘液注入流動室中,細胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心,逐個流過檢測窗口。光學系統中光源照射通過檢測窗口的細胞,從而產生光信號。光源分為兩種,其一用于產生明場細胞圖像,另一種是用于產生熒光細胞圖像的激光器。定制的全固態激光器,功率高且可調節,有利于同時檢測多種熒光信號或是微弱信號。 另外的 785 nm 激光器,用于檢測側向角(SSC)參數,極大提高了該參數的檢測靈敏度。光源照射細胞產生的光信號被大數值孔徑的物鏡收集,然后通過光路系統傳遞到由二向色鏡構成的濾光片堆棧。光信號在這里被分成不同波段投射到 CCD 的相應檢測通道上,產生明場細胞圖像、暗場細胞圖像和多個熒光通道的細胞圖像,即每個細胞可以獲取 12 副不同成像。ImageStream 技術的檢測系統十分,采用不是傳統流式細胞儀的 PMT 檢測方式,而是基于時間延遲積分技術的 CCD(TDI (time delay integration) CCD)采集,保證了系統對高速運動的流體細胞也能采集高質量圖像。
ImageStream 系統配有功能強大的數據分析軟件 IDEAS,可以對每個細胞分析超過 500 種量化參數。這些參數不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度,還包括對細胞形態,細胞結構及亞細胞信號分布的分析。
從 2005 年開始,Amnis 量化成像流式分析儀被廣泛應用于生物化學、藥物研發、血液、免疫、微生物、海洋、腫瘤、寄生蟲、干細胞、毒理、病毒等各個領域。隨著 ImageStream 高速顯微成像流式細胞技術的發展成熟,越來越多的科研人員開始將這種革命性的技術手段運用到自身的研究領域,并發表了大量有影響力的論文。
Amnis 量化成像流式細胞儀的常見應用
Imagestream 成像流式細胞儀對每個細胞進行成像,不僅可以根據 G0/G1 期、S 期和 G2/M 期 DNA 含量的不同進行區分,還可以根據 M 期細胞核形態的不同將 M 期中前期、中期、后期和末期細胞進行區分,因此可以計算出細胞周期中 G0/G1 期、S 期、G2/M 期及 M 期中前期、中期、后期和末期細胞的比例。這大大提高了流式細胞儀對細胞周期的分析能力。
細胞凋亡(apoptosis)指為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主有序的死亡。 細胞凋亡首先出現的是細胞體積縮小,連接消失,與周圍的細胞脫離,然后是細胞質密度增加,線粒體膜電位消失,通透性改變,釋放 到胞漿,核質濃縮,核膜核仁破碎,DNA 降解成為約 180bp-200bp 片段;胞膜有小泡狀形成,膜內側磷脂酰外翻到膜表面,胞膜結構仍然完整,最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體,無內容物外溢,因此不引起周圍的炎癥反應,凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。細胞凋亡的指標有多種,可以判斷凋亡的不同時期。從早期凋亡的細胞膜磷脂酰外翻,到中期凋亡的 Caspase 活化、 的釋放、線粒體膜電位的喪失等,到晚期凋亡的核酸內切酶在核小體之間剪切核 DNA,產生大量長度在 180-200 bp 的 DNA 片段。在成像流式細胞儀上,只要使用 PI 染色即可以區分活細胞、壞死細胞和凋亡細胞。這是因為在活細胞中 PI 染色為陰性,壞死細胞和凋亡細胞 PI 染色為陽性,但壞死細胞的細胞核保持完整形態,而凋亡細胞發生了 DNA 的凝集,因此可以根據細胞核形態的不同對壞死細胞和凋亡細胞進行區分和統計。
細胞活性、分化及宿主防御功能受到多種過程調節,其中轉錄因子從細胞質到細胞核的轉運過程是一個重要環節。IDEAS®軟件利用形態學量化參數 Similarity,通過對相關轉錄因子和細胞核的圖像進行自動分析處理,精確量化細胞內蛋白分子的核轉運程度。例如核因子 NF-кB 信號通路主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激、細胞分化和調亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞。 在多數細胞類型,NF-кB 在胞漿與抑制性蛋白質結合形成無活性的復合物。當腫瘤壞死因子等作用于相應受體后,可通過第二信使激活此系統。激活過程是通過磷酸化抑制性蛋白使其構象改變而從 NF-кB 脫落,使得 NF-кB 得以活化?;罨?NF-кB 進入細胞核,與 DNA 接觸,并啟動或抑制有關基因的轉錄。因此未活化的 NF-кB 位于細胞質,而活化后的 NF-кB 位于細胞核。傳統的流式細胞儀只能檢測細胞整體熒光強度,而無法區分位于細胞不同部位的熒光的細胞。成像流式根據每個細胞的圖像判斷該細胞是否發生 NF-кB 信號通路的活化。
納米藥物具有許多傳統藥物所不具備的優勢,如顯著提升藥物的作用效果和靶向性,在改善治療效果的同時降低藥物毒副作用對機體的影響;調節釋藥速度,改變藥物在體內的分布;提高藥物溶解度和生物利用度等。納米藥物的研究已經成為現代醫學發展和藥物創新的重要方向,在預防與控制癌癥等重大疾病研究領域都有望取得重要突破,極有可能在不遠的將來釋放巨大的經濟和社會效益。
納米藥物雖然是具有巨大發展前景的新型藥物,但納米藥物在臨床應用中的生物機制,以及納米藥物作用的細胞模型都非常欠缺,亟需發展。納米毒理學,納米藥物動力學,納米藥物結構優化和功能測定都亟需具備高通量和高內涵性能的新型細胞學水平研究工具。量化成像分析流式細胞儀以其高通量的數據獲取能力和量化成像分析能力很好地滿足了納米藥物的研究需求,為許多已經發表重要的高水平工作提供了關鍵性的數據,引起業內同行的高度重視。
量化成像流式細胞儀對納米材料的研究主要有兩種方式。一種是通過衡量納米藥物在細胞內部的熒光來判斷納米藥物在細胞內的攝入程度,即內化值,內化值越大,表示細胞內部攝入的納米藥物越多;第二種是通過計算細胞內部所攝入的納米藥物熒光點的數目來衡量納米藥物的攝入程度。
近年來腫瘤的取得了巨大的進步,尤其是嵌合體抗原受體修飾 T 細胞 (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T) 技術在治療白血病、神經膠質瘤、淋巴瘤、神經母細胞瘤等惡性腫瘤,取得了較大的成果。CAR-T 技術治療腫瘤的步驟包括提取患者 T 細胞,進行體外基因轉染操作將腫瘤相關抗原的單鏈抗體表達于 T 細胞膜表面,在體外擴增 CAR-T 細胞,并回輸 CAR-T 細胞到患者體內對腫瘤進行殺傷。來自耶魯大學的 Patrick 等科學家則將這一技術更加推動一步,十分巧妙的設計和合成了模擬抗體類似特性的化合物 SyAM-P,該化合物一端可以結合到前列腺癌細胞表面抗原 PSMA,一端結合免疫細胞表面 FcγRI,通過這種方式可以使免疫細胞靶向殺傷前列腺癌細胞,如圖 6 所示。
當 SyAM-P 引導單核細胞靶向前列腺癌細胞后,單核細胞通過吞噬效應進行前列腺癌細胞的殺傷。與傳統流式不同的是,Amnis 可以結合圖像清晰的觀察到效應免疫細胞對腫瘤細胞的吞噬過程,如圖 7 所示。其中 Target 為綠色熒光標記的前列腺癌細胞,Effector 為紅色熒光標記的單核細胞,圖 7 上方是單核細胞已經完成對前列腺癌細胞吞噬后的細胞圖像,可見綠色的前列腺癌細胞位于單核細胞內部,而圖 7 下方則是單核細胞正在進行吞噬過程的細胞圖像,可見單核細胞與前列腺癌細胞之間吞噬杯的形成。