鈣檢測流式細胞儀分析檢測試劑盒提供了基于熒光的測定法，用于使用流式細胞儀檢測細胞內鈣動員。它可以用于動力學讀數或終點讀數。將Calbryte 520 AM染料加載到細胞中后，只需洗滌細胞并添加鈣通量激動劑，即可通過流式細胞儀使用動力學讀取模式或終點讀取模式讀取樣品。 Calbryte 520 AM可以通過擴散被動地穿過細胞膜。一旦進入細胞內部，Calbryte 520 AM的親脂性封閉基團就會被酯酶裂解，產生帶負電荷的熒光染料，并留在細胞內部。與鈣結合后，其熒光大大增強。當用激動劑刺激表達目的GPCR的細胞時，受體會發出釋放細胞內鈣的信號，這會明顯增加Calbryte 520的熒光。該檢測試劑盒也可用于檢測細胞鈣通量作為細胞分選。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的 鈣檢測流式細胞儀分析檢測試劑盒。
| 流式細胞儀 | |
| 激發: | 488nm激光 |
| 發射: | 530/30nm濾波片 |
| 通道： | FITC通道 |
| 其他可用儀器： |
| FDSS, ViewLux, NOVOStar, ArrayScan, FlexStation, IN Cell Analyzer |
樣品實驗方案
簡要概述
在測定緩沖液中準備細胞
添加Calbryte 520 AM染料加載溶液（1 µL）
在37°C孵育30分鐘
清洗細胞
添加鈣通量激動劑
在530/30 nm濾光片（FITC通道）使用流式細胞儀檢測熒光強度
溶液配制
儲備溶液配制
Calbryte 520 AM儲備溶液（500X）：在Calbryte 520 AM儲備溶液（組分A）的小瓶中加入100 µL DMSO（未提供），并充分混合。 注意：100 µL Calbryte 520 AM儲備溶液足以進行100次測定。 如果試管密封嚴密，可以將未使用的Calbryte 520 AM原液分裝并在<-20°C下保存超過一個月。 避光并避免重復的凍融循環。
實驗步驟
1.除去細胞培養基，并加入0.5 mL測定緩沖液。注意：對于貼壁細胞和非貼壁細胞，建議分別使用4 x 105 – 8 x 105和1 x 106-2 X 106。每個細胞系應根據個體情況進行評估，以確定細胞內鈣動員的細胞密度。
2.將1µL Calbryte 520 AM儲備溶液（500X）加到0.5 mL非標準或貼壁細胞的測定緩沖液（組分B）中。注意：如果細胞（例如CHO細胞）含有有機陰離子轉運蛋白，則可將丙h舒（組分C）添加到染料工作溶液中（孔濃度將為0.125-1 mM），以減少去離子水的泄漏。
3.將細胞在37°C下孵育30分鐘。
4.對于非貼壁細胞，將細胞離心并去除染料。將細胞重懸于0.4 mL HHBS（組分D）中。對于貼壁細胞，使用0.5 mM EDTA輕輕地將細胞從板中提起并離心。將細胞重懸于0.4 mL HHBS（組分D）中。注意：要從板上分離貼壁細胞，可以考慮使用酶試劑（例如胰dan白酶，Accutase），但需要進行測試以確保細胞表面上的目標受體不受影響。
5.用HHBS或所需的緩沖液制備5X激動劑化合物。
6.使用530/30 nm濾光片（FITC通道）在流式細胞儀上檢測，在添加100 µL制備的激動劑之前和之后分析樣品。注意：為獲得結果，重要的是在添加激動劑后1分鐘內進行測定。確保激動劑添加到實際讀數開始之間的時間對于所有樣品保持恒定。
